肺结核是由结核分枝杆菌感染引起的一种慢性呼吸道传染病，我国是全球结核病高负担国家之一，2018年全人群报告结核病发病率为59.27/10万，学生结核病报告发病率为17.97/10万^[1]，学生肺结核疫情呈上升趋势^[2]。虽然国家对学校结核病防控工作高度重视，但学校结核病聚集性疫情乃至突发公共卫生事件仍屡有发生，不仅损害了学生身体健康，也影响了正常的教育秩序，甚至引起很大的社会负面影响^[3]。在已报道的学校结核病聚集性疫情调查研究中，绝大多数限于传统的流行病学调查和基本的实验室检查^[4]。本文综述了我国学校结核病聚集性疫情发生报告及处置判断情况，并就基因分型技术在学校结核病聚集性疫情同源性分析中的应用进行探讨，以期能够科学准确地判断学校结核病聚集性疫情。

1.   我国学校肺结核病例发现主要途径

目前，我国学校肺结核病例发现主要通过升学或入学体检、学生或教师因症就诊、教职工年度体检3种途径，聚集性疫情则主要通过确诊病例的密切接触者筛查发现。我国多个省(区)市学生肺结核流行特征分析显示，每年3—5月和9—10月是学生结核病报告的主要时间，聚集性疫情大多发生在此时间段，主要与学生参加中考、高考体检和新生入学体检有关^[5-8]。密切接触者筛查是早期发现潜伏期感染者和活动性肺结核患者的有效方法，也是学校结核病聚集性疫情发现的主要途径。据统计，2009—2013年全国发生的21起学校结核病聚集性疫情中，首发病例因症就诊确诊后通过密切接触者筛查或全体师生筛查发现16起(76.19%)，学生高考体检4起(19.05%)，因症就诊和高考学生体检1起(4.76%)^[9]。周丽平等^[10]对湖北省发生的10起学校结核病聚集性疫情分析发现，有7起通过升学体检确诊后主动筛查发现，2起为首发病例因症就诊确诊后通过密切接触者筛查发现，1起为教师年度体检确诊后通过密切接触者筛查发现。另如南充市等多个市发生的多起学校结核病聚集性疫情发现方式均与之类似^[11-13]。2011—2015年北京市海淀区在高校本科入学新生结核病筛查中发现聚集性疫情28起^[14]。合肥市2011—2016年发生的7起学校结核病聚集性疫情均通过密切接触者筛查和扩大筛查发现^[15]。因此，及时开展新生入学结核病筛查和结核病患者密切接触者筛查，对早期发现潜在肺结核患者(传染源)和预防学校结核病聚集性疫情的发生具有重要意义^[16-17]。

2.   我国学校肺结核病聚集性疫情判断处置方法

《学校结核病防控工作规范(2017版)》规定^[18](以下简称《规范》)，学校应按有关规定将结核病检查项目作为新生入学体检和教职员工常规体检的必查项目。被诊断为肺结核后，疾病预防控制部门将开展如下工作：(1)病例个案调查。调查内容包括患者的基本情况，发病、就诊和诊疗经过，发病后的主要活动及场所，目前的健康状况、结核病接触史等。(2)划定密切接触者范围。密切接触者是指与肺结核病患者直接接触的人员。如果在同班、同宿舍师生筛查中发现1例及以上肺结核病例，密切接触者筛查范围将扩大到与病例同一教学楼和宿舍楼楼层的师生。(3)密切接触者筛查。筛查方法包括结核病可疑症状筛查、结核菌素皮肤试验(PPD)、胸部X线检查等。(4)筛查结果异常者做进一步检查。对有结核病可疑症状、结核菌素试验强阳性、胸部X线检查有异常的密切接触者转介到结核病定点医疗机构进一步检查。(5)病例管理。对疑似病例进行隔离并鉴别诊断，对活动性肺结核患者进行全程规范抗结核治疗、督导管理和休复学管理，对潜伏期感染者进行预防性治疗，对拒绝预防性服药者在首次筛查后3个月末、6个月末、12个月末到定点医疗机构分别进行一次X线胸片检查。(6)病例之间流行病学关联判断。密切接触者经定点医疗机构进一步检查确诊感染肺结核的，由疾病预防控制部门根据病例的分布情况、密切接触程度、接触时间长短、接触场所环境状况等流行病学调查资料作出病例间是否存在流行病学关联的判断。(7)疫情判断和报告反馈。当1所学校在同一学期发现3~9例有流行病学关联的结核病病例判定为聚集性疫情；发生≥10例有流行病学关联的结核病病例，或出现结核病死亡病例的，判定为突发公共卫生事件。达到突发公共卫生事件标准的，疾病预防控制部门在调查核实后上报《突发公共卫生事件管理信息系统》；未达到突发公共卫生事件标准的，由属地疾病预防控制部门向同级卫生行政部门、上级疾病预防控制机构和学校报告、反馈。

3.   我国现行学校结核病聚集性疫情判断处置存在问题和建议

3.1   医院诊断能力水平不够，病例痰检率和阳性率低

《规范》要求对肺结核可疑症状者、PPD强阳性者、胸部X线异常者应收集3份痰标本进行痰涂片和痰培养检查，培养阳性菌株进行菌种鉴定。但目前结核病定点医疗机构进行学校结核病聚集性疫情患者痰涂片和痰培养检查，多数是为了开展药敏试验指导临床用药，很少对痰检阳性标本进行菌种鉴定溯源和病例传播链研究。病原学阳性是确诊肺结核的“金标准”^[19]。由于结核病实验室诊断技术比较落后、对患者留痰质量重视不够、实验室技术人员水平低等原因^[20]，我国痰培养阳性率平均仅为33%，低于全球57%的平均水平^[21]。广州市胸科医院对11 742例可疑结核病患者痰涂片检查的阳性率为32.89%^[22]，陕西省汉中市2012—2017年肺结核痰涂片阳性率从6.48%下降至4.42%^[23]。国内报道的多起学校结核病聚集性疫情痰涂片阳性率仅为6.56%~30.43%^[24-27]，远低于国家“十三五”规划到2020年结核病患者病原学阳性率达到50%以上的要求^[28]。我国诊断的肺结核患者中约有70%为菌阴患者，菌阴患者中只有50%~80%是真正的患者^[20]。刘二勇等^[29]对我国病原学检测阴性肺结核的诊断现状调查发现，53.5%的患者仅依靠胸部影像学检查进行诊断，9.7%的患者存在误诊或过诊。《学校肺结核患者密切接触者筛查及处置规范》明确了PPD、γ干扰素释放试验(IGRA)和ESAT-6/CFP-10蛋白皮肤试验均可用于学校结核病密接者筛查，特别是结核感染检测方面^[30]。中国防痨协会建议，在处置学校结核病暴发疫情时先进行抗结核抗体感染检测(TB-SA)，阳性者再进行胸片、涂片等检查^[31]。而王前等^[32]对我国县级结核病定点医疗机构结核病诊断能力调查显示，在2 316家县级结核病定点医疗机构中，能开展结核病CR、DR、CT/MRI检查者比例分别为29.79%，88.77%，75.86%，能开展PPD、IGRA、TB-SA者分别占70.73%，23.01%，66.02%。鉴别和及时诊断痰涂阳性病例，特别是在疫情暴发的早期阶段，是防止密切接触者之间进一步传播的关键。大量研究表明，采用液体培养法和分子检测等新技术可以显著提高结核分枝杆菌阳性检出率^[33-35]。我国基层结核病定点医疗机构结核病诊断能力水平较低，临床医生仅凭胸片和临床症状诊断肺结核容易出现过诊或误诊，可能出现夸大学校疫情规模的情况，不利于学校结核病聚集性疫情的科学准确判断。

3.2   疫情判定和病例流行病学诊断缺乏病原学支持，病例传播链不完整

我国是结核病大国，人群中结核分枝杆菌感染率高，结核病患病率也高。由于结核病具有潜伏感染的特点，学生结核病发病是由内源性复燃还是近期传播感染所致，一直是困扰人们的难题^[36]。高中、大中专院校学生来自全国各地，本身就潜藏着许多潜伏期感染者(传染源)，入学后由于学习压力大、不良生活习惯、缺乏体育锻炼等原因导致身体免疫力下降，短时间内先后发病，或虽未发病但通过同班级或同年级的密切接触者筛查中被发现。按传统流行病学调查思维，这些先后发现的病例从分布来看似乎存在流行病学关联，往往被判定为聚集性疫情。而采用基因分型技术鉴定可能发现病例间不存在流行病学关联，感染可能来自不同传染源，有的甚至是患者自身原发病灶复燃导致。因此，单纯依靠病例分布判断是否有流行病学关联并不科学。目前我国学校结核病聚集性疫情判断主要依据病例之间的密切接触情况，即是否存在流行病学关联，但判断标准存在较大的主观性和不确定性^[20]。一般认为，密切接触者发病是由于“指示病例”传染导致的，但随着基因分型技术的发展，这个传播关系的证据链被证明并不准确。有研究发现，上海有相当数量的密切接触者感染并非由“指示病例”传染导致，而是源于其他感染者^[37]。李玉新等^[36]对一起学校结核病暴发疫情临床株基因型同源性分析发现，6株临床分离株中有4株具有同源性，2株为非同源性。李建翠等^[38]对某中学结核病聚集性疫情的研究也发现病例感染来源于不同的传染源，即病例之间不存在传播关系。王胜芬等^[4]对某高级中学的结核病突发疫情实验室鉴定发现该事件是由结核分枝杆菌和猪分枝杆菌混合感染引起。

3.3   疫情判定处置缺乏基因分型技术，病例溯源存在不足

由于我国诊断的学生病例中绝大多数是菌阴患者，所以聚集性疫情的判定只能以流行病学关联作为评估，但随着结核分枝杆菌基因分型技术的发展，准确判断患者之间的传播关系已成为可能^[20]。目前常用的基因分型方法主要有插入序列6110限制性片段长度多态性分析技术(IS6110-RFLP)、间隔区寡核苷酸分型技术(Spoligotyping)、多位点串联重复序列分析技术(MIRU-VNTR)、单核苷酸多态性分析(SNP)、长片段多态性分析技术(LSP)、全基因组测序技术(WGS)、耐药相关基因突变谱分析(drug-resistance mutation)、基因芯片分型技术(genechip)等，主要用于了解结核病传播、病原演变、耐药产生原因、流行病学调查分析等方面，在结核病的预防、治疗和控制中具有重要意义^[39]。

近年来结核分枝杆菌基因分型技术发展迅速，在使用过程中各有优缺点。IS6110-RFLP分辨率较高，特异性较强，有一定的稳定性，但培养周期较长(3~6周)，对IS6110拷贝数低于5的菌株难以分型，操作繁琐、费时，结果读识困难，在一般实验室难以推广^[39-41]，目前主要作为补充和参考标准使用^[42]。Spoligotyping需菌量少、操作简单、重复性好，检测结果读取方便，易于实验室间结果比较，但分辨率低，仅适用于结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)初筛和基因群的分型^[43]。MIRU-VNTR操作简单、分辨率高、成本低廉、重复性好、结果容易分析^[39-41]，但位点的选择有很强的地域性^[44]。LSP和SNP均有较高的遗传稳定性，适用于系统发育学研究^[45]，但两者的分辨率均不高，且SNP价格昂贵，无法在实验室间推广，在追踪传染源、查找传播途径方面不如传统的基因分型技术^[40]。WGS通过测序可以获得结核分枝杆菌全基因组系列信息，并能进行菌种鉴定、获得耐药突变信息等，可以从分子水平分析传染源、代系、区域之间的传递规律，缺点主要是费用较高^[39]。Drug-resistance mutation辅助于其他技术，仅针对耐药结核分枝杆菌^[39]。基因芯片技术已发展出多种测序芯片，如菌种分型鉴定芯片、耐药基因突变检测芯片等，但该技术费用较高，需要特定的设备^[39]。

提供操作简单、结果读取快速、特异性好的检查方法是目前结核分枝杆菌基因分型技术研究的重点。目前IS6110-RFLP、MIRU-VNTR和Spoligotyping是国内外流行病学研究中最常用的3种方法，已有相应的标准操作流程，且MIRU-VNTR和Spoligotyping已有相应的国际数据库网站^[40-41]。Spoligotyping被公认为北京型菌株鉴定的金标准^[46]，常与MIRU-VNTR或IS6110-RFLP组合用于结核分枝杆菌基因分型分析^[47-48]。Liu等^[49]采用Spoligotyping和MIRU-VNTR组合对“北京家族”亚型进行研究时，分辨率高达99.89%。国内多个省份因地制宜采用不同的基因分型方法对本地区主要流行菌株进行分析，并获得了较好分析结果^[50-54]。MIRU-VNTR目前已被广泛应用于结核病暴发疫情的流行病学调查^{[36, 38, 41]}，美国疾病预防控制中心建议作为结核分枝杆菌基因分型的首选方法^[55]，中国疾病预防控制中心已确定了15个位点分型操作法作为中国结核分枝杆菌分型的标准化操作^[56]。Jeon等^[57]采用24个位点法对结核病高危人群进行队列调查研究，You等^[58]对某寄宿性高中肺结核暴发疫情阳性菌株进行基因型分析，结果均表明MIRU-VNTR法具有优越的识别能力。多项研究^{[4, 36, 38]}采用MIRU-VNTR法均成功识别出学校结核病聚集性疫情病例之间的流行病学关系。此外，由于WGS较其他基因分型技术具有更高的分辨率，已被越来越多的国家用于全国疫情或国际跨境疫情的调查^[59]。Arnold等^[60]采用WGS在伦敦一起广泛耐药结核病疫情中证实了患者之间的关联性。上海的一项研究表明^[61]，WGS可以有效研究MTB分离株的传播动力学，在缺乏广泛的流行病学数据的情况下，WGS基于系统发育树仍可以用来识别可能的传染源、超级传播者和确定传播方向。

虽然目前尚未有任何一种基因分型方法能够完全具备快速、分辨率高、操作简便、重复性好、费用低廉的条件，在实际使用过程中往往需要联合多种方法才能达到理想的分型^[39-41]。但在应对类似湖南省桃江四中结核病聚集性疫情^[3]，采取基因分型技术厘清病例之间的流行病学关系仍显得十分必要。国内有学者呼吁应该采用现代基因分型技术与传统流行病学分析相结合的方法定义学校结核病聚集性疫情^[20]，以替代传统聚集性疫情认定方式。《学校结核病疫情流行病学调查和现场处置专家共识》^[62]提出，学校结核病流行病学关联的判定应在传统流行病学调查的基础上，对阳性病例菌株进行菌种鉴定和基因型分型，以判断导致患者发病菌株之间的同源性，为明确流行病学关联及传播链提供分子水平的证据。实践也证明，采用基因分型技术能够很好地判断学校结核病聚集性疫情病例之间的流行病学关系^{[4, 36, 38, 58, 60]}。

综上所述，如何科学准确判断学校结核病聚集性疫情是当前我国学校结核病防控工作急需解决的问题。要解决这个问题，首先要提高基层结核病定点医疗机构肺结核诊断能力水平，特别是提高结核分枝杆菌阳性检出率。在此基础上，采用适合的基因分型技术进行菌种鉴定和代系传播关系研究，建立更加科学准确的疫情判断标准，减少疫情对社会造成的负面影响。